（篇幅較長，耐心讀，一定受益匪淺）

研究目的與意義：1974年首次發(fā)現(xiàn)m6A甲基化，它是一種RNA分子上的甲基化修飾，m6A修飾在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是動(dòng)態(tài)可逆的，類似于DNA和組蛋白修飾的另一種表觀遺傳調(diào)控，近年來m6A甲基化已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通過諸多學(xué)者辛苦研究，結(jié)果表明在mRNA中發(fā)現(xiàn)的m6A修飾可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生命活動(dòng)。另外我們知道EMT是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞特質(zhì)的一種重要現(xiàn)象，通過EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（例如Snail，Slug，Twist和Zeb）來抑制e-cadheri的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，此外，Snail是e-cadherin表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，近年來圍繞EMT的表觀遺傳調(diào)控因素做了諸多研究，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化及組蛋白修飾等均可參與腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生發(fā)展，但mRNA修飾對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT的影響尚未揭示。

一、癌細(xì)胞中EMT受mRNA的甲基化水平調(diào)控

以上所有這些數(shù)據(jù)表明用TGF-β處理的癌細(xì)胞正在進(jìn)行EMT過程。

為了證明m6A在EMT過程中的作用，作者使用CRISPR / Cas9編輯系統(tǒng)，在HeLa細(xì)胞中敲低METTL3，形成 METTL3Mut/− HeLa細(xì)胞。下圖是METTL3在野生型及METTL3Mut/− HeLa細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況。

進(jìn)一步通過LC-MS/MS分析，結(jié)果顯示，METTL3 Mut/− HeLa 細(xì)胞的m6A水平顯著低于野生型細(xì)胞，這也證實(shí)了METTL3作為mRNA的m6A具有介導(dǎo)催化作用。

這些數(shù)據(jù)表明METTL3的缺失可以抑制癌細(xì)胞EMT的發(fā)生；

進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)印跡分析顯示ALKBH5的過表達(dá)增加了E-Cad，同時(shí)降低了HeLa細(xì)胞中的MMP2和FN。

此外，在METTL3Mut/−HeLa和Mett13敲低的Huh7細(xì)胞中恢復(fù)了由TGF-β誘導(dǎo)的E-Cad下調(diào)和FN上調(diào)。 

根據(jù)上述數(shù)據(jù)已經(jīng)知道METTL3的缺失可以抑制癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，作者進(jìn)一步研究了METTL3的臨床作用。TCGA數(shù)據(jù)顯示，METTL3在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織。

在364名肝癌患者中，METTL3的表達(dá)與CDH1 mRNA呈負(fù)相關(guān)。這種關(guān)聯(lián)與上述數(shù)據(jù)呈現(xiàn)結(jié)果一致 。

根據(jù)Bertero等的報(bào)道，TGF-β可通過Smad2 / 3與METTL3-METTL14- WTAP復(fù)合物之間的相互作用誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞（hESCs）中的mRNA甲基化。通過使用Smad2 / 3抑制劑B431542（10μM）預(yù)處理HeLa細(xì)胞，然后用TGF-β進(jìn)一步處理3天，通過LC-MS/MS測(cè)定總mRNA的m6A 與A的比例，來計(jì)算m6A在mRNA上整體的甲基化程度。發(fā)現(xiàn)Smad2/3抑制劑SB431542（SB）可以阻礙TGF-β誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞中m6A的上調(diào)。 

二、EMT的細(xì)胞，m6A會(huì)調(diào)控其它基因的變化

總的來說，m6A-seq數(shù)據(jù)顯示m6A修飾發(fā)生在EMT期間與細(xì)胞連接，粘附和遷移相關(guān)的少數(shù)基因上。

為了驗(yàn)證Sainl是參與m6A調(diào)節(jié)的癌細(xì)胞EMT的潛在靶點(diǎn)，作者通過在EMT期間鑒定84個(gè)EMT的相關(guān)基因和61 個(gè)m6A調(diào)節(jié)基因（大于2倍m6A變化），最終確定了四個(gè)重疊基因。分別為SANI1、CTGF、MSN、CTNNB1，在四種鑒定的基因中，Snail被認(rèn)為是控制EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子。作者的數(shù)據(jù)證實(shí)Sainl mRNA被m6A修飾，并且在EMT進(jìn)展期間在CDS和3'UTR區(qū)域中m6A的顯著富集，另外，作者通過RIP技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在EMT細(xì)胞中，m6A水平的Sainl-mRNA顯著增加，富集倍數(shù)與對(duì)照相比約為2.3倍。

接下來，作者研究了在HeLa細(xì)胞中敲低METTL3、以及過表達(dá)ALKBH5時(shí)Snail蛋白的表達(dá)情況，。在METTL3缺失和ALKBH5過表達(dá)的兩種情況下，作者觀察到HeLa和HepG2細(xì)胞中Snail蛋白水平的降低而ZEB1表達(dá)沒有變化。

為了證實(shí)m6A對(duì)Snail表達(dá)有作用，作者用TGF-β處理野生型和METTL3Mut /-HeLa細(xì)胞。結(jié)果顯示，在METTL3Mut /-HeLa細(xì)胞中，TGF-β誘導(dǎo)的Snail表達(dá)低于對(duì)照細(xì)胞，這表明m6A參與TGF-β誘導(dǎo)的癌細(xì)胞中Snail的表達(dá)。

四、m6A促進(jìn)癌細(xì)胞中Snail mRNA的翻譯

用Act-D處理野生型和METTL3Mut /-HeLa細(xì)胞以阻斷轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示野生型細(xì)胞中pre-mRNA和mat-mRNA的半衰期顯著短于METTL3Mut /-HeLa 細(xì)胞。表明m6A修飾可能引發(fā)pre-mRNA的剪切和癌細(xì)胞中Snail mat-mRNA的降解。

另外作者補(bǔ)充證實(shí)，Snail是YTHDF2的靶標(biāo)，其負(fù)責(zé)m6A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物的mRNA去穩(wěn)定化。過量表達(dá)YTHDF2可降低HeLa細(xì)胞中成熟Snail mRNA的表達(dá)和穩(wěn)定性；

此外，作者用MG132預(yù)處理METTL3Mut /-HeLa細(xì)胞以抑制蛋白體外酶活性和使用CHX阻斷蛋白翻譯，然后用TGF-β處理。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，在CHX而非MG132存在下， TGF-β誘導(dǎo)的METTL3Mut /-HeLa細(xì)胞中的Snail表達(dá)減弱。

隨后作者將Snail CDS連接到多克隆位點(diǎn)（MCS）構(gòu)建了pmirGLO-Snail熒光素酶報(bào)告基因。 雙熒光素酶測(cè)定顯示，Snail在METTL3Mut /-HeLa細(xì)胞中的翻譯效率顯著低于野生型細(xì)胞。

下面作者對(duì)RNA進(jìn)行分類，通過多聚核糖體分析，發(fā)現(xiàn)METTL3Mut /-HeLa細(xì)胞中80S的核糖單體和多聚核糖體都低于野生型細(xì)胞。

表明在EMT過程促進(jìn)SNAI1 mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯。

作者通過對(duì)m6A-RIP測(cè)序，數(shù)據(jù)顯示CDS區(qū)域中m6A峰值位于第20條染色體上，48,600,490 to 48,600,630且在3 'UTR。

作者鑒定了3個(gè)GGAC motif，分別位于CDS區(qū)域和Snail mRNA的3'UTR區(qū)域；

下面作者對(duì)m6A甲基化對(duì)SNAI13'UTR及CDS區(qū)域分別作了詳細(xì)研究。

這表明3'UTR上的m6A甲基化可能不參與m6A修飾調(diào)節(jié)的Snail表達(dá)；

數(shù)據(jù)顯示，在過量表達(dá)pcDNA-Snail-CDS-mut1的METTL3Mut細(xì)胞中部分上調(diào)了Snail表達(dá)水平（上圖）。將pcDNA-Snail-CDS-WT、pcDNA-Snail CDS-mut1 / mut2轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞進(jìn)行TGF-β處理。 蛋白印跡結(jié)果顯示，TGF-β誘導(dǎo)的pcDNA Snail-CDS-mut1的Snail表達(dá)低于pcDNA-Snail-CDS-WT和pcDNA-Snail-CDS-mut2（下圖）。

總之，結(jié)果數(shù)據(jù)表明SNAI1 CDS區(qū)域中的m6A是表達(dá)調(diào)控的主要位置；

由于真核生物的翻譯延伸是由兩個(gè)延伸因子作用進(jìn)行的，：eEF-1和eEF-2，作者觀察了MetE13Mut -HeLa細(xì)胞中eEF-1和eEF-2結(jié)合Snail mRNA的變異。數(shù)據(jù)顯示，在METTL3Mut-HeLa細(xì)胞中Snail mRNA和eEF-2之間的結(jié)合顯著低于HeLa細(xì)胞中的結(jié)合。 此外，通過蛋白定性分析表明，得到了類似的結(jié)果。 

六、m6A與癌細(xì)胞發(fā)展有關(guān)

這表明Snail參與了METTL3的體內(nèi)轉(zhuǎn)移作用。