近日，Nature子刊 Cell Death & Differentiation先后在線發(fā)表了兩篇circRNA相關(guān)研究論文：

本篇文章的通訊作者是青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院發(fā)育心臟病學(xué)中心主任王昆教授，介紹發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注模型中一種自噬相關(guān)circRNA（ACR）能夠通過(guò)結(jié)合Dnmt3b抑制Pink1基因的甲基化，促進(jìn)Pink1的表達(dá)，Pink1可促進(jìn)FAM65B的磷酸化并抑制自噬的進(jìn)程，在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中保護(hù)細(xì)胞[1]。

本篇文章的通訊作者是華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院童強(qiáng)松和鄭麗端。本文介紹AGO2基因內(nèi)含子來(lái)源的circRNA（circAGO2）可結(jié)合HuR并促進(jìn)其在靶基因3’UTR富集，阻止AGO2復(fù)合物結(jié)合，促進(jìn)了靶基因的穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤進(jìn)程[2]。 

下面讓我們分別學(xué)習(xí)一下兩篇文章的故事吧：

ACR 參與自噬調(diào)控 

自噬是重要的細(xì)胞生理活動(dòng)過(guò)程，circRNA與自噬的關(guān)系之前已有相關(guān)報(bào)道，包括東南大學(xué)姚紅紅教授分別于2017年8月份和12月份發(fā)表于Autophagy雜志的兩篇文章，分別介紹了circHIPK2/miR-124-2HG/SIGMAR1軸通過(guò)調(diào)控自噬和ER Stress通路調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞活化作用[3]，circRNA HECW2/miR-30D調(diào)控ATG5和Notch1通路[4]。在本篇文章中，作者通過(guò)芯片法分析了心肌缺血再灌注（I/R）后小鼠心肌circRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)mmu_circRNA_006636在I/R后顯著下調(diào)，作者將其命名為自噬相關(guān)circRNA（Autophagy related circular RNA, ACR）

進(jìn)一步，作者通過(guò)RNase R處理前后QPCR證明ACR的環(huán)形結(jié)構(gòu)，過(guò)表達(dá)ACR等實(shí)驗(yàn)證明ACR過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞自噬過(guò)程。

圖1 ACR與細(xì)胞自噬有關(guān) （引自[1]）

缺氧/復(fù)氧（A/R）處理后ACR的表達(dá)會(huì)顯著下降，過(guò)表達(dá)ACR后A/R處理導(dǎo)致的LC3聚集斑點(diǎn)有所減少，LC3-II也比對(duì)照組有所下降，說(shuō)明過(guò)表達(dá)ACR可抑制自噬過(guò)程。電子顯微鏡分析后也表明過(guò)表達(dá)ACR后由A/R處理誘導(dǎo)的自噬小泡數(shù)量減少。

圖2 過(guò)表達(dá)ACR抑制自噬 （引自[1]）

敲低ACR后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組芯片分析，探索與ACR相關(guān)的下游通路分子。結(jié)果表明在敲降A(chǔ)CR后，Pink1和Irgm1顯著下降，QPCR和Western也驗(yàn)證了這一變化。但過(guò)表達(dá)ACR后Pink1增加的非常明顯，Irgm1變化不顯著。因此將ACR相關(guān)的通路鎖定在對(duì)Pink1的調(diào)控作用上。

圖3 ACR調(diào)控分子分析 （引自[1]）

作者發(fā)現(xiàn)Pink1的啟動(dòng)子存在CpG甲基化區(qū)域，因此懷疑Pink1的表達(dá)是通過(guò)啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)調(diào)控的。DNA甲基化抑制劑5-Aza處理后能顯著增加Pink1的表達(dá)，進(jìn)一步佐證了這個(gè)機(jī)制。通過(guò)抗Dnmt1，Dnmt3a，Dnmt3b的抗體分別RIP實(shí)驗(yàn)，表明只有Dnmt3b能夠富集ACR。靶向ACR的探針Pull-down也能夠特異性富集Dnmt3b。敲降A(chǔ)CR后Pull-down實(shí)驗(yàn)中Dnmt3b的富集減弱。Dnmt3b是否可以靶向Pink1的啟動(dòng)子并調(diào)控其表達(dá)呢？通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)證明，Dnmt3b可以靶向結(jié)合Pink1的啟動(dòng)子，敲降A(chǔ)CR后結(jié)合變強(qiáng)。干擾Dnmt3b能夠增加Pink1蛋白水平。A/R和I/R處理后靶向Pink1的Dnmt3b顯著增多。這些實(shí)驗(yàn)表明ACR通過(guò)結(jié)合Dnmt3b，抑制其與Pink1啟動(dòng)子的結(jié)合。

圖4 ACR通過(guò)Dnmt3b調(diào)控Pink1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) （引自[1]）

進(jìn)一步，作者在體外和體內(nèi)證明了Pink1調(diào)控自噬通路。為了找到Pink1調(diào)控自噬過(guò)程的機(jī)制，作者利用CoIP后Western鑒定的方法證明Pink1與FAM65B相互作用?；谫|(zhì)譜分析和抗體驗(yàn)證，證明S46是Pink1靶向FAM65B的位點(diǎn)

圖5 Pink1靶向調(diào)控FAM65B的磷酸化 （引自[1]）

本文的工作比較細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)，環(huán)環(huán)相扣，一步步證明了ACR與Dnmt3b相互作用，抑制后者結(jié)合Pink1的啟動(dòng)子。在缺氧/復(fù)氧或心肌缺血再灌注條件下維持細(xì)胞內(nèi)Pink1的水平，抑制自噬通路的過(guò)度激活。本文的機(jī)制屬于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合蛋白的“protein sponge”模型，值得廣大同行學(xué)習(xí)借鑒。

circAGO2參與RNA穩(wěn)定性調(diào)控 

AGO2是RISC復(fù)合物中唯一具有內(nèi)切核酸酶活性的亞基成分，發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá)的狀態(tài)。在這篇文章中作者發(fā)現(xiàn)了來(lái)自AGO2內(nèi)含子的一種circRNA（circAGO2）能夠結(jié)合HuR蛋白，促進(jìn)HuR在靶基因的3’UTR富集，阻止AGO2的結(jié)合，調(diào)控靶基因的穩(wěn)定性。

circBase數(shù)據(jù)庫(kù)中AGO2基因來(lái)源的circRNA共有6種，在胃癌AGS中能檢測(cè)到其中的兩種，其中一種（hsa_circ_0135889）在前列腺癌和結(jié)腸癌和胃癌組織中明顯高于癌旁組織，將其命名為circAGO2。Sanger測(cè)序鑒定其序列，F(xiàn)ISH分析亞細(xì)胞定位表明circAGO2主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。常見(jiàn)的細(xì)胞系中進(jìn)行Northern實(shí)驗(yàn)表明在腫瘤細(xì)胞中存在明顯的circAGO2高表達(dá)，其分子量也與預(yù)期一致。

圖6 circAGO2鑒定 （引自[2]） 

MKN-5細(xì)胞中過(guò)表達(dá)及AGS中干擾circAGO2表明circAGO2的表達(dá)與細(xì)胞侵襲明顯相關(guān)。皮下成瘤實(shí)驗(yàn)也表明高表達(dá)circAGO2后MKN-5成瘤增強(qiáng)，干擾circAGO2后AGS細(xì)胞成瘤減弱。尾靜脈注射兩種細(xì)胞也證明circAGO2表達(dá)與腫瘤遷移密切有關(guān)。

圖7  circAGO2促進(jìn)腫瘤遷移 （引自[2]）

Pull-down實(shí)驗(yàn)分析與circAGO2互作的蛋白分子，質(zhì)譜分析找到767種circAGO2互作的蛋白分子，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索RBP蛋白及已知的AGO2結(jié)合蛋白，鎖定了四種潛在的互作蛋白：TARDBP, RPL27A,RBM4和HuR。但進(jìn)一步的Pull-down驗(yàn)證表明只有HuR能夠特異性的在circAGO2探針捕獲分子中富集。電泳遷移率改變分析（EMSA），GST融合標(biāo)簽Pull-down， FISH共定位分析也證明了circAGO2與HuR相互作用。

圖8 circAGO2與HuR相互作用分析 （引自[2]）

CoIP實(shí)驗(yàn)證明HuR與AGO2有相互作用。過(guò)表達(dá)和干擾circAGO2后轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)合CLIPdb數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，表明有132種基因3’UTR存在AU-rich的序列（ARE）。miRWalk工具分析了這些ARE附近的結(jié)合miRNA，RIP分析表明HuR與AGO2均可與這些基因的3’UTR結(jié)合，過(guò)表達(dá)circAGO2促進(jìn)HuR與靶基因的結(jié)合，但同時(shí)會(huì)抑制AGO2的結(jié)合。結(jié)合干擾HuR，過(guò)表達(dá)miRNAs。在多種細(xì)胞中驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。

圖9 circAGO2調(diào)控HuR與AGO2的功能 （引自[2]）

作者還進(jìn)一步分析了穩(wěn)定干擾circAGO2對(duì)成瘤能力的影響。基于HuR與circAGO2相互作用的分子模擬，設(shè)計(jì)了可阻斷該相互作用的小肽HIP-13，實(shí)驗(yàn)表明該多肽能有效競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合內(nèi)源circAGO2，阻礙其與HuR的結(jié)合并抑制腫瘤遷移作用。

本文的故事豐富了我們對(duì)AGO2調(diào)控靶基因的機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也證明了circRNA是一類重要的功能分子，對(duì)探索circRNA的機(jī)制和功能提供了很有價(jià)值的借鑒。

參考文獻(xiàn)：

1. Lu-Yu Zhou, M.Z., Yan Huang, Sheng Xu,  Tao An,  Yun-Hong Wang,  Rong-Cheng Zhang, Cui-Yun Liu,  Yan-Han Dong,  Man Wang,  Li-Li Qian,  Murugavel Ponnusamy,  Yu-Hui Zhang,  Jian Zhang, Kun Wang, The circular RNA ACR attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury by suppressing autophagy via modulation of the Pink1/FAM65B pathway. Cell Death & Differentiation, 2018.

2. Yajun Chen, F.Y., Erhu Fang, Wenjing Xiao, Hong Mei, Huanhuan Li, Dan Li, Huajie Song, Jianqun Wang, Mei Hong, Xiaojing Wang, Kai Huang, Liduan Zheng, Qiangsong Tong, Circular RNA circAGO2 drives cancer progression through facilitating HuR-repressed functions of AGO2-miRNA complexes. Cell Death & Differentiation, 2018.

3. Huang, R., et al., Circular RNA HIPK2 regulates astrocyte activation via cooperation of autophagy and ER stress by targeting MIR124-2HG. Autophagy, 2017: p. 0.

4. Yang, L., et al., Engagement of circular RNA HECW2 in the nonautophagic role of ATG5 implicated in the endothelial-mesenchymal transition. Autophagy, 2017: p. 1-70.